高效液相色譜方法的開發是一個繁復的過程，但不管再繁復，也有其規律可尋。方法開發過程中，一個總的原則是：先找到目標化合物的峰，然后調整峰形，再是進一步完善。
找到目標化合物的峰：
要找到目標化合物的峰，我們該如何開展工作，先舉一個例子，下面是分析氟康唑氯化鈉注射液的一個譜圖：
譜圖上的內容主要包括：色譜柱、波長、流動相、溫度、流速和進樣量這幾項。這意味著如果這幾個色譜條件都確定下來了就可以基本認為這個方法已經開發成功，所以開發方法時我們可以通過逐一的考查這幾個色譜條件來進行。
考查色譜條件是需要通過在色譜儀上進樣來進行的，這就需要我們首先確立一個初始條件，即回答從何開始的問題。在回答好“從何開始”這個問題之前，我們先要了解我們的被分析物，就像一場戰爭，首先要知道自己的敵人是誰一樣，我們要了解它的物理、化學性質，特別是化學結構式非常關鍵。所以，色譜方法開發工作可以通過如下的步驟來展開：
1）收集資料：
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對它的分子量、結構式，以及在水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、正己烷和異丙醇中的溶解度有一個初步的了解。對分子量的了解在選擇色譜柱的過程中是非常重要的，因為色譜柱填料的孔徑對化合物的分離具有重要的影響，例子如圖：
由此可以看出填料孔徑對分離度和峰形是有一定影響的，120A的色譜柱通常適用的范圍為分子量<10000的，如果分子量太大，在填料為120A孔徑的柱子上分離度會比較差，因為樣品分子在色譜柱上有較好的保留是由于可以進入到填料的微孔里面，與鍵合在表面上的C18長鏈相互作用，通?？讖街睆叫枰笥诜肿又睆降?倍以上才不會對分析造成影響。因此一般分子量10000一下的化合物建議用120A的柱子來分析，分子量大于1W小于20W的用300A的來分析，分子量大于20W的就要用凝膠柱了。
結構式對于分子極性大小的預測以及后續調整峰形時具有非常重要的作用，如－COOH、－NH2、－NHR、－NR2、－OH等都是極性基團，而苯環、己環、－CH＝、－CH2－CH3等都是非極性基團，根據經驗大致對其極性做一下判斷，估計一下可能在C18上（用得最多，我們最熟悉）的保留性能如何，再結合目標化合物在上述所說的幾種溶劑中的溶解度狀況，對方法開發時可能用正相柱還是反相柱來作一個粗略的判斷，以及方法開發完成后的認證有作用。
2）選擇色譜柱
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I）填料孔徑的選擇：根據所查資料獲得的化合物分子量信息來確認色譜柱填料的孔徑；
II）填料鍵合相（鍵合相是指C18、C8、苯基柱等）的選擇：在沒能查到做過該樣品的相關資料之前，或者并不了解其極性之前，通常最好選擇C18柱作為初始的色譜條件。因為C18柱是我們用得最多的，也是對其色譜保留性能最了解和熟悉的，在C18柱上獲得的信息我們可以預測其極性，以及為解決遇到的問題問題下一步可能將采取的措施。
III）填料粒徑、色譜柱型號的選擇：在沒有特別指明之前，最好使用我們常用的5um、4.6×150mm或250mm，和前面首選C18作初始條件一樣，是為了方便預測其保留性能。
3）檢測器和波長的選擇
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目前使用最為普遍的是UV檢測器，因此，在不了解其是否有紫外吸收的情況下，我們先要了解其這一性能，用標準品配成合適的溶液進行紫外掃描，收集目標化合物最大吸收波長的數據，確定波長；
或者是在有DAD檢測器的條件下進幾針標準品溶液，通過DAD的三維譜圖可以獲得化合物最大吸收波長的相關信息。
如無紫外吸收，則需選用合適的檢測器。因為檢測器是我們監測化合物是否出峰的工具，是我們的能看到化合物的“眼睛”，也是我們開發方法的基礎，因此非常重要，需認真選擇。
4）流動相的選擇
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流動相的選擇需要根據檢測方式來確定，這里以UV檢測器為例。液相的流動相最常用的體系有兩種，一種是甲醇和水的體系，一種是乙腈和水的體系。
這兩種流動相體系沒有太大的差異，但還是區別的：
主要區別在于：
1）甲醇價格比乙腈便宜很多；
2）乙腈的洗脫能力比甲醇強；
3）甲醇在紫外上的吸收截止波長在210nm左右，也就是說在210nm以下基線的本底會比較高，與乙腈相比會大大降低化合物的峰高，削弱目標化合物的檢測靈敏度；
乙腈的吸收截止波長在190nm左右；如果確定的波長在210nm以下，則應該選擇乙腈和水作為流動相體系，如果遠離這個波長的地方，則甲醇應該是首選。
5）流速的選擇：與上述所確定的色譜柱型號相對應的流速，4.6mm內徑色譜柱選1ml/min。
6）溫度的選擇：如化合物對溫度沒有特別的需求（如溫度高了不穩定等），則在方法開發之初，盡量使用室溫，這樣開發出來的方法普適性會比較廣一些。升高溫度往往在后面為了提高目標化合物與其它雜質的分離度時使用的，或者為了降低柱壓等，在進一步優化色譜條件時才去考慮。
綜合以上所選擇的一些條件作為初始條件，就可以開始下一步的目標——“找到目標化合物峰”。要找到目標化合物的峰，首先就要在我們最熟悉的C18柱上面測試一下，了解化合物的保留能力和大致的極性。
具體的步驟是：先用純甲醇做流動相，看化合物是否被洗脫下來，如果被洗脫下來峰高是多少，收集這些數據；
然后流動相中甲醇的比例以10％的速度遞減，即甲醇：水＝90：10、80：20、70：30。。。。純水，看流動相從最初的100％甲醇——100％水的過程中每變動10％的比例，譜圖上會多些什么峰，峰高會不會發生變化，多出來的峰是從哪里來的；
這個過程會有三種結果：
1）純甲醇條件下沒能洗脫下來，這樣說明化合物的極性很弱，保留能力非常強，應該可以考慮用正相體系來做，如選擇硅膠柱；
2）純水條件下很難出峰而純甲醇時很快洗脫下來，這意味著我們可以通過調整流動相的比例找到這個峰，并結合前面流動相比例10％變化的系列數據，選擇合適的流動相。
3）純水條件下也仍然很快就出峰，這說明化合物的極性很強，此時需要結合分子的結構式來判斷，有可能是哪些基團導致了樣品這么快的出峰，然后采取相應的對策，考慮添加緩沖鹽，調節pH，如果需要的話，甚至考慮添加離子對試劑。
